O ACCT é uma ferramenta de contagem automática de células rápida e acessível que usa aprendizado de máquina para segmentação de imagens 2D

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 8213 (2023) Citar este artigo

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A contagem de células é a pedra angular do rastreamento da progressão da doença na neurociência. Uma abordagem comum para esse processo é fazer com que pesquisadores treinados selecionem e contem células individualmente em uma imagem, o que não é apenas difícil de padronizar, mas também muito demorado. Embora existam ferramentas para contar células automaticamente em imagens, a precisão e acessibilidade de tais ferramentas podem ser melhoradas. Assim, apresentamos uma nova ferramenta ACCT: Contagem Automática de Células com Segmentação Weka Treinável, que permite a contagem automática flexível de células por meio da segmentação de objetos após o treinamento orientado pelo usuário. O ACCT é demonstrado com uma análise comparativa de imagens publicamente disponíveis de neurônios e um conjunto de dados interno de células da micróglia coradas por imunofluorescência. Para comparação, ambos os conjuntos de dados foram contados manualmente para demonstrar a aplicabilidade do ACCT como um meio acessível para quantificar células automaticamente de maneira precisa, sem a necessidade de clusters de computação ou preparação avançada de dados.

A quantificação de células em imagens de imunofluorescência tem sido uma etapa limitante em tempo e esforço exigido para a análise de dados de microscopia usados ​​em pesquisas. Essas técnicas de análise seletiva de imagem podem fornecer informações fisiológicas valiosas e contagens manuais por profissionais treinados têm sido consideradas o "padrão ouro" para quantificação1,2.

Aqui usamos contagens manuais completas de vários observadores separados para comparação com uma metodologia de contagem automática de células. Tradicionalmente, um aspecto importante para manter a consistência na quantificação de células tem sido garantir que um conjunto de dados seja contado por um único observador que busca precisão e reprodutibilidade enquanto, idealmente, está cego para as condições experimentais. Isso limita enormemente a velocidade na qual os dados de contagem de células podem ser processados, pois aumentos na mão de obra nem sempre se traduzem em maior velocidade. A contagem manual pode ter problemas com reprodutibilidade e consistência em um conjunto de dados devido a erro humano e fadiga. Tais problemas podem ser evitados utilizando modelos computacionais que permanecem consistentes em qualquer número de imagens.

Para isso, apresentamos aqui o ACCT: Automatic Cell Counting with Trainable Weka Segmentation (TWS) hospedado no GitHub em https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git. O TWS fornece uma base de aprendizado de máquina para nossa metodologia acessível de contagem automática de células, com potencial de processamento de imagem adicional fornecido por scripts em ImageJ, Python e BeanShell3,4. O programa TWS fornece uma interface gráfica do usuário (GUI) para treinamento e aplicação de um classificador de aprendizado de máquina que diferencia entre pixels celulares e não celulares, que são então agrupados em objetos celulares e contados. O ACCT é construído em torno dessa segmentação de pixel para fornecer validação quantitativa no nível celular e auxiliar na seleção e aplicação do classificador ideal (Fig. 1). O ACCT processa imagens de canal único fornecidas pelos usuários. As imagens com vários canais podem ser analisadas usando cópias de imagens mostrando um canal por vez e processando conjuntos de imagens para cada canal separadamente.

Dois conjuntos de dados são usados ​​neste estudo para demonstrar o desempenho em contextos de imagem variados. O primeiro conjunto de dados utilizado é composto por imagens da micróglia em camundongos com e sem condições de ativação imunológica e inflamatória provocadas pela expressão transgênica da proteína do envelope gp120 do vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1)5. Este modelo de NeuroHIV (camundongo HIVgp120tg) fornece um resultado observável das contagens manuais, um aumento na micróglia na presença de HIVgp120 (doravante referido como Ativado) versus a ausência da proteína viral (controle de ninhada não transgênico, referido como Em repouso). O ACCT foi usado para avaliar a diferença no número de células da micróglia das imagens representadas na Fig. 2. Para que uma metodologia de contagem automática seja eficaz em um contexto experimental, ela deve ser capaz de acomodar a variabilidade na apresentação de dados resultante das condições experimentais6. Sabe-se que a micróglia sofre alterações morfológicas durante a ativação que alteram sua morfologia e aparência quando visualizadas por meio de coloração imunofluorescente7,8. Nós nos concentramos em um conjunto de dados de imagens de células marcadas por imunofluorescência para a proteína 1 do adaptador de ligação ao cálcio ionizado (Iba-1), que é um marcador específico do tipo de célula e permite a visualização da microglia. No entanto, a metodologia e os scripts que acompanham permitem a quantificação automática de células em uma ampla variedade de contextos de imagem.